Identificación de 2,4

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 14292 (2023) Citar este artículo

Detalles de métricas

El compuesto 2,4-diacetilfloroglucinol (DAPG) es un antibiótico de amplio espectro producido principalmente por Pseudomonas spp. DAPG juega un papel importante en el biocontrol de enfermedades suprimiendo la actividad de Pseudomonas spp. En el presente estudio, informamos el descubrimiento del grupo biosintético DAPG en cepas de Chromobacterium vaccinii aisladas de ambientes acuáticos brasileños y la distribución del grupo biosintético en el género Chromobacterium. El análisis filogenético de la proteína phlD sugiere que el grupo biosintético probablemente ingresó al género Chromobacterium después de un evento de transferencia horizontal de genes con un miembro del grupo Pseudomonas fluorescens. Pudimos detectar trazas de DAPG en cultivos de tipo salvaje y confirmar la función del grupo con expresión heteróloga en Escherichia coli. Además, identificamos y verificamos la presencia de otros metabolitos secundarios en estas cepas. También confirmamos la capacidad de las cepas de C. vaccinii para producir el pigmento bioactivo violaceína y el depsipéptido cíclico bioactivo FR900359. Se ha informado que ambos compuestos tienen actividades antimicrobianas e insecticidas. Estos compuestos sugieren que las cepas de C. vaccinii deberían explorarse más a fondo por su potencial como agentes de biocontrol.

El compuesto 2,4-diacetilfloroglucinol (DAPG) es un antibiótico de amplio espectro que se aisló originalmente de una cepa fluorescente de Pseudomonas1. DAPG es sintetizado por un grupo de policétido sintasa de tipo III que comprende el operón phlABCDE2,3. La síntesis la inicia el gen phlD, que produce floroglucinol a partir de malonil-CoA2. Posteriormente, el floroglucinol se acila para producir monoacetilfloroglucinol (MAPG), y una segunda acilación conduce a la producción de DAPG4.

Posteriormente, esta molécula se puede utilizar para suprimir organismos que causan enfermedades en el suelo y es un componente importante de los “suelos supresores de enfermedades”5 y en aplicaciones de biocontrol6. El DAPG es muy eficaz para controlar el agente causal de la “disminución total” del trigo (Gaeumannomyces tritici)7 y la “podredumbre negra de la raíz del tabaco” (Thielaviopsis basicola)8. Además de controlar estos ascomicetos fúngicos, se ha informado que el DAPG inhibe el oomiceto Pythium ultimum9, la bacteria Gram negativa Erwinia carotovora subsp. atroseptica10 y la bacteria Gram positiva Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis11. La ecología y el uso de DAPG en aplicaciones de biocontrol siguen siendo objeto de intensos estudios12,13,14.

Las especies de Chromobacterium pertenecen a la clase de bacterias Gram negativas, Betaproteobacteria. Se han estudiado cepas de Chromobacterium por muchas razones, como su capacidad para ser un patógeno oportunista15 y como sistema modelo para la detección de quórum en bacterias Gram-negativas16. Chromobacterium ha sido una rica fuente de moléculas bioactivas17,18,19. Recientemente, se han utilizado y desarrollado como agentes de biocontrol para controlar plagas de insectos20,21 y para controlar patógenos de plantas22,23,24,25.

En este estudio, mientras exploramos la diversidad de Chromobacterium en un sistema fluvial brasileño, identificamos cepas de Chromobacterium vaccinii que poseían un grupo biosintético de policétido sintasa con homología con el operón phlACBDE26. Esto proporcionó motivación para determinar la distribución de este grupo en Chromobacterium spp. y confirmar la bioactividad del cluster.

La cepa tipo de C. vaccinii DSM 25150T se obtuvo directamente de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares de DSMZ. Chromobacterium vaccinii CR1 y CR5 fueron aislados previamente de ambientes acuáticos en Brasil26. Ambas cepas se aislaron de agua superficial cruda, que se recogió directamente en matraces esterilizados del cuerpo de agua entre 0 y 30 cm de profundidad, en el que la recolección y conservación de las muestras se realizó de acuerdo con la Guía Nacional de Recolección y Conservación de Muestras. : agua, sedimentos, comunidades acuáticas y efluentes líquidos27. C. vaccinii CR1 se aisló del arroyo João Leite, Goiânia, Goiás, Brasil. Ubicación geográfica 16° 34′ 30.54" S; 49° 13′ 55.02" WC. Vaccinii CR5 se aisló del río Meia Ponte, Goiânia, Goiás, Brasil. ubicación geográfica 16° 54′ 16,3'' S; 49° 07′ 37,8'' W. Los detalles del aislamiento fueron según Gomes et al.28.

El medio acuático donde se aislaron las cepas CR1 y CR5 es un río y su afluente. Estas aguas también se ven impactadas por muchas presiones antropológicas, como las actividades industriales, agroindustriales (ganadería y una intensa producción de productos hortícolas), además de ser utilizadas para el ocio. El clima de la cuenca es tropical con dos estaciones bien definidas, seca y lluviosa, perteneciente al bioma Cerrado28.

La versión del sitio web del software antiSMASH 6.0 se utilizó para identificar supuestos grupos de metabolitos secundarios en los genomas de C. vaccinii CR1, CR5 y DSM 25150T29. Los grupos que no se asignaron de manera confiable en el software antiSMASH 6.0 se buscaron manualmente utilizando el software BLAST para determinar una función potencial. Para determinar la distribución del clúster DAPG, se utilizó como referencia el clúster (identificado como GenBank LQR3212800..LQR32_12830). Estos loci se buscaron manualmente utilizando el software BLAST en todos los genomas disponibles (al 1 de junio de 2022) en el género Chromobacterium. Además de los genes biosintéticos del grupo DAPG (phlACBDE), buscamos el gen regulador asociado con el grupo (phlF, phlG, phlH) que se encuentra comúnmente en las cepas de Pseudomonas, se utilizó como referencia el acceso: CM001558.

El genoma central del género Chromobacterium se determinó y alineó utilizando el programa BIGSdb30. Aquitalea magnusonii DSM 23134T se incluyó como grupo externo. El árbol filogenético se construyó utilizando el software MEGA 1131. El árbol de unión de vecinos se determinó utilizando el modelo Tamura-Nei (0,40, distribución gamma con sitios invariantes). Se obtuvieron medidas de soporte de arranque para ramas internas a partir de 1000 pseudoréplicas. Para la filogenia PhlD, la proteína PhlD se identificó en el genoma de C. vaccinii CR1 y se buscó utilizando el software BLAST contra todas las proteínas no redundantes disponibles en GenBank. Todas las proteínas disponibles (9) del género Chromobacterium se incluyeron en la alineación. Debido a la gran cantidad de proteínas de Pseudomonas disponibles, solo se incluyó una muestra representativa (11). Un Streptomyces sp. La proteína (PhiD) se utilizó como grupo externo. Todas las alineaciones se realizaron utilizando MUSCLE implementado bajo MEGA 1131. La alineación se probó en modelo en MEGA 11 y se seleccionó el método de Máxima Verosimilitud con el modelo WAG. Se obtuvieron medidas de soporte de arranque para ramas internas a partir de 1000 pseudoréplicas.

El ADN genómico se extrajo de 1 ml de un cultivo nocturno de C. vaccini DSM 25150T como se describió anteriormente por32. El supuesto grupo phlACB (~ 2,8 KB) se amplificó a partir del ADN genómico de C. vaccini DSM 25150T utilizando el grupo de cebadores F (ATG AAG AAG GCA GGC ATA GTG AGC TAT GGC AG) y el grupo R (ATC TTC CAG CAC GAA CTT GTA GGC GTA TTG CCA) utilizando ADN polimerasa Invitrogen Platinum SuperFi II (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) según las instrucciones del fabricante. El producto de PCR purificado en gel se volvió a amplificar con nuevos cebadores que contenían los sitios de restricción Nco I (extremo 5') y Hind III (extremo 3') para la clonación en el vector de expresión pET28b. Después de la ligación, se identificaron tres clones de expresión independientes con el grupo phlACB a partir de plásmidos que se habían transformado en E. coli DH 5α. La secuencia correcta del grupo phlACB amplificado en cada clon se verificó comparándola con la secuencia del genoma de C. vaccini CR1 después de la secuenciación de cada clon utilizando un secuenciador de ADN MiSeq. Los clones de plásmido phlACB.1, phlACB.3 y phlACB.5, así como el vector vacío pET28b, se transformaron individualmente en BL21 E. coli.

Cada línea celular BL21 phlACB de E. coli, así como las células BL21 de control con pET28b, se cultivaron durante la noche en caldo LB con kanamicina (50 µg/ml). Luego se usó el cultivo nocturno para inocular medio mínimo M9 (200 µl de inóculo en 10 ml de medio) con kanamicina (50 µg/ml) y se cultivó a 37 °C con agitación (180 RPM) hasta que la DO 600 alcanzó 0,6. Posteriormente, cada cultivo recibió 1 mg de DAPG (disuelto en etanol, Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan) e isopropil-β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) para una concentración final de 0,2 mM, y se incubaron a 30 °C. de los cultivos se retiraron en varios momentos y se almacenaron a 4 °C.

Para cada momento (1, 2, 3, 4 y 7 días) y cada condición del medio (LB o KMB), se analizaron 5 μL de medio de cultivo de Chromobacterium mediante LC-MS utilizando un HPLC Vanquish equipado con una columna ODS-18. (3 mm × 150 mm, tamaño de partícula de 3 μm, Inertsil, GL Sciences, Inc., Torrance, CA) la elución de los analitos se realizó mediante un gradiente lineal de 5:95–95:5 % de agua de 18 MΩ + ácido fórmico al 0,1 %. : Metanol de calidad óptima + ácido fórmico al 0,1 % a un caudal de 0,550 ml/min durante 30 min a 50 °C. El efluente de la columna se controló mediante UV a longitudes de onda de 254 nm, 280 nm y 270 nm antes de su introducción en un espectrómetro de masas tribrido Orbitrap ID-X (ThermoElectron, West Palm Beach, CA) bajo control Xcalibur 4.4. En la trampa orbital se recogieron datos espectrales de masas de 200 a 2000 Da m/z con una resolución de 120.000. Los datos espectrales de masas en tándem de los metabolitos objetivo se recopilaron mediante disociación por colisión de mayor energía (HCD, CE = 25 y 35) en el analizador Orbitrap.

Se centrifugaron alícuotas de medio de E. coli en los tiempos 8, 20,5, 28,5, 48 y 68 h de tres transformantes (pET28-phlACB-1, -3, -5) y un control de sólo plásmido (pET28) a 10.000 RPM durante 10 minutos. Se extrajo una muestra del sobrenadante (250 µL) y se diluyó con 250 µL de agua de 18 MΩ. Una parte de esta dilución (5 μL) se analizó mediante LC-MS en las mismas condiciones de LC enumeradas anteriormente, con la única modificación de los análisis espectrométricos de masas fue reducir la masa de detección a 100-1000 Da m/z para permitir la detección de floroglucinol y MAPG. Se analizaron estándares auténticos para DAPG y floroglucinol (Acros Organics, Geel, Bélgica) a 100 μg/ml para establecer tiempos de retención y patrones de fragmentación MS2 de los productos esperados. Según las especificaciones del fabricante, el nivel de detección de estos analitos es de aproximadamente 100 pg/ml en estas condiciones.

Las cepas CR1 y CR5 de Chromobacterium vaccinii fueron aisladas originalmente de ambientes acuáticos en el estado de Goiás, Brasil26. La cepa tipo de C. vaccini DSM 25150T también se incluyó en el análisis33. La Tabla 1 muestra que se encontraron cinco grupos en las tres cepas. El software antiSMASH solo pudo asignar la función de la violaceína y los posibles grupos DAPG. Se identificó mediante el software BLAST que un gran grupo trans-AT-PKS de 68,4 kb era el grupo biosintético del depsipéptido cíclico FR90035934. Los dos últimos grupos pequeños (6,9 y 8,6 kb) poseen dominios que sugieren que son probables sideróforos.

El descubrimiento inicial del potencial grupo biosintético de DAPG en genomas de cepas seleccionadas de C. vaccinii impulsó la exploración de la distribución de este grupo en el género Chromobacterium, dada la importancia histórica de esta molécula que normalmente se encuentra en Pseudomonas spp. cepas12. Después de una investigación más amplia utilizando todos los genomas de Chromobacterium disponibles, el grupo se identificó en 11 genomas del género que aparecieron en tres clados principales (Fig. 1). Los resultados muestran que el grupo se encontró en todos los genomas de C. vaccinii y en una cepa de Chromobacterium piscinae estrechamente relacionada. Se identificó un segundo clado que contiene el grupo en Chromobacterium sphagni. El tercer clado estaba formado por Chromobacterium amazonense y una nueva especie estrechamente relacionada y descrita recientemente de Chromobacterium sinusclupearum35. El grupo tenía una amplia distribución geográfica con siete de las cepas de Estados Unidos36,37,38, dos de Brasil26, una de China (CP022344) y una de Malasia39.

Distribución de grupos biosintéticos de DAPG y depsipéptido FR900359 en el género Chromobacterium. La filogenia se basa en el genoma central de las cepas enumeradas en la figura. Se obtuvieron medidas de soporte de arranque para ramas internas a partir de 1000 pseudoréplicas. Aquitalea magnusonii DSM 23134T se utilizó como grupo externo y no se muestra.

Todos los genes biosintéticos del grupo DAPG (phlACBDE) se encontraron en todas las cepas de Chromobacterium que contenían el grupo. Curiosamente, las cepas de Chromobacterium no contienen todos los genes reguladores asociados con este grupo en las cepas de Pseudomonas. Normalmente, el grupo DAPG en las cepas de Pseudomonas contiene los genes phlF, phlG y phlH, que se sabe que regulan la expresión del grupo12. Las cepas de Chromobacterium solo contienen el gen phlF y carecen de los genes phlG y phlH, lo que sugiere que utilizan un mecanismo regulador diferente al de las cepas de Pseudomonas.

Además, el grupo biosintético del depsipéptido FR900359 también se limitó a los genomas de C. vaccinii y a una cepa muy relacionada, C. piscinae XC0014. El grupo biosintético de violaceína se encontró en todos los genomas de la Fig. 1, excepto en los dos genomas de Chromobacterium phragmitis.

Se creó una filogenia de la proteína policétido sintasa PhlD, que es fundamental para el grupo DAPG, para comprender el posible origen del grupo. La Figura 2 muestra que el grupo estaba estrechamente relacionado con cepas del grupo Pseudomonas fluorescens40. La identidad de aminoácidos promedio entre los proteomas de C. vaccinii CR1 y el proteoma de Pseudomonas más cercano fue del 47%, mientras que la identidad de aminoácidos promedio entre dos grupos de DAPG fue del 80%. En todos los genomas de Chromobacterium que contenían el grupo, el grupo estaba en la misma región física del genoma y compartía las mismas regiones flanqueantes. Un estudio de los genomas de Chromobacterium que carecen del grupo no encontró ningún gen o grupo alternativo en este sitio de inserción.

Filogenia de máxima probabilidad de la proteína PhlD del grupo biosintético DAPG. Se obtuvieron medidas de soporte de arranque para ramas internas a partir de 1000 pseudoréplicas.

Para confirmar la asignación y actividad de los grupos biosintéticos, se utilizó LC-MS/MS para confirmar la presencia de los metabolitos en el cultivo. Los tres grupos biosintéticos asignados fueron violaceína, depsipéptido FR900359 y DAPG. La Figura 3 muestra la confirmación de la asignación de violaceína y depsipéptido FR900359 mediante espectrometría de masas de alta precisión. Para las tres cepas, la señal de la violaceína fue fuerte y el depsipéptido FR900359 fue mucho más débil. Se observó una señal muy débil para DAPG en las cepas, lo que era consistente con el tiempo de retención y la espectrometría de masas de un estándar de referencia DAPG. Según los resultados, se asumió que el grupo DAPG estaba activo pero no altamente expresado en estas condiciones de cultivo. Evaluamos la producción de DAPG en una variedad de condiciones de cultivo (71 fuentes de carbono diferentes usando placas Biolog) para determinar si podíamos mejorar la expresión de la actividad de DAPG. En todas las condiciones de crecimiento probadas, ninguna de las condiciones mejoró significativamente la producción de DAPG.

Datos de LC-MS de Chromobacterium vaccinii CR1. (A) Cromatogramas de iones extraídos de violaceína (negro-m/z 344,1–344,2 Da); y depsipéptido FR900359 (marrón-m/z 1002,5–1002,6 Da); (B) espectro de masas de violaceína; (C) espectro de masas en tándem de violaceína; (D) espectro de masas de FR900359; (E) espectro de masas en tándem de FR900359.

Para confirmar la actividad del grupo de genes Chromobacterium phlACB en el metabolismo de DAPG, el grupo se transformó en E. coli. Cabe señalar que la expresión de los genes phlACB de Pseudomonas fluorescens en E. coli dio como resultado la conversión de floroglucinol en 2-acetilfloroglucinol (MAPG, 20%) y 3% de DAPG en el medio de cultivo2. Las pruebas iniciales de E. coli que expresan phlACB de Chromobacterium no produjeron DAPG a partir de floroglucinol. Achkar et al. También encontraron que la incubación del transformante de E. coli con DAPG condujo a la conversión completa de DAPG en MAPG (9%) y floroglucinol (22%) en 48 h2. Esto nos motivó a establecer la actividad de phlACB en dirección de DAPG a floroglucinol. Por lo tanto, los cultivos se cultivaron en 100 µg/ml de DAPG para determinar la actividad de transformación de DAPG en MAPG y floroglucinol. Las muestras de biotransformación de DAPG, de transformaciones por triplicado, se analizaron mediante LC-UV-MS/MS para confirmar la identidad de los productos (Fig. 4). Las muestras a lo largo del tiempo durante la incubación se controlaron mediante UV a 270 nm (panel superior de las figuras 4A a D), la absorbancia máxima para DAPG. La señal UV y el cromatograma de iones extraídos de DAPG permanecieron constantes para la reacción de control donde E. coli solo con plásmido fue el biocatalizador durante 48 h (Fig. 4A, C). E. coli que expresa phlACB mostró una disminución en la señal UV y EIC para DAPG en el transcurso de 48 h, mientras que tuvo un aumento de la señal para MAPG (14,30 min según lo determinado por UV y masa precisa, error <1 ppm, debido a la falta de estándar auténtico) y floroglucinol (a las 48 h, 2,92 min según la masa exacta y la comparación con el estándar auténtico). En tiempos de reacción más largos con E. coli que expresa phlACB, las señales DAPG y MAPG disminuyeron y aparecieron picos UV adicionales.

Datos LC-UV-MS de control y E. coli transformada incubadas con 100 μg/ml de DAPG. Los medios de cultivo se diluyeron 1:1 con agua 18 MΩ antes del análisis. Negro-UV a 270 nm (λmax para DAPG); cromatograma de iones extraídos en marrón de 211,05 a 211,07 m/z; cromatograma de iones extraídos en verde de 169,00 a 169,20 m/z; cromatograma de iones extraídos en azul de 127,03 a 127,05 m/z. DAPG a los 24,3 min, MAPG a los 14,3 min, floroglucinol a los 2,9 min. (A) Control de 8 h. (B) 8 h flACB. (C) Control de 48 h. (D) 48 h flACB. E. Estructuras, masas y vía de degradación de DAPG.

DAPG ha sido una molécula importante en las bioactividades de la rizosfera que coloniza especies de Pseudomonas y ha sido objeto de extensas investigaciones durante 40 años12. Es por esta razón que nos pareció interesante descubrir que cepas de C. vaccinii aisladas de ambientes acuáticos tienen el grupo DAPG26. La cepa tipo de C. vaccinii y otros aislados representativos de C. vaccinii se aislaron originalmente de la rizosfera y ambientes acuáticos asociados con arándanos nativos y cultivados (Vaccinium macrocarpon Ait.)33. Esta coincidencia sugiere que DAPG podría proporcionar una función ecológica similar en Chromobacterium a la observada en las especies de Pseudomonas. En las especies de Pseudomonas, se sabe desde hace mucho tiempo que el DAPG suprime los fitopatógenos y otros microbios en la rizosfera41. Además, se demostró que las cepas de Pseudomonas que contienen DAPG eran un componente clave de los suelos supresores de enfermedades para controlar la “disminución generalizada” de la enfermedad de la raíz del trigo5. Es posible que el DAPG en Chromobacterium pueda desempeñar un papel ecológico similar para las plantas en pantanos o ambientes acuáticos similares. También es digno de mención que estos géneros están relacionados sólo lejanamente, y el clado compartido más cercano está a nivel de filo (Proteobacteria) con Chromobacterium que pertenece a la clase Betaproteobacteria y Pseudomonas que pertenece a la clase Gammaproteobacteria.

La distribución del grupo biosintético DAPG en el género Chromobacterium se limita a unos pocos clados diferentes. Es interesante encontrar que todos los miembros de C. vaccinii, C. sphagni y C. sinusclupearum tienen este grupo (Fig. 1). Sin embargo, estas especies tienen una representación genómica limitada con 5, 2 y 2 genomas completos secuenciados, respectivamente. Esto sugiere que existe una presión de selección para mantener el grupo en la especie, especialmente en C. vaccinii, donde todas las cepas provienen de ambientes diversos. El análisis también muestra que el grupo DAPG tiene una amplia distribución geográfica con genomas de América del Norte, América del Sur y Asia. Además del grupo DAPG, identificamos otros dos grupos biosintéticos en los genomas de interés, el depsipéptido FR900359 y la violaceína. Lo más sorprendente es que el depsipéptido FR900359 apareció junto con DAPG en las cepas de C. vaccinii, mientras que la violaceína apareció en todos los genomas de Chromobacterium con la excepción de los dos genomas de C. phragmitis. No está claro si DAPG y el depsipéptido FR900359 son una adaptación a una necesidad ecológica específica o si su correlación es una coincidencia.

Se descubrió que el depsipéptido FR900359 es un inhibidor potente y selectivo de los receptores acoplados a proteína G (GPCR) en humanos y otros mamíferos42,43. Los GPCR son elementos importantes para la transducción de señales intracelulares que responden a la unión de ligandos externos y a las cascadas de respuesta inicial a través del intercambio de trifosfato de guanosina y difosfato de guanosina44. Ahora el depsipéptido FR900359 y compuestos estrechamente relacionados, conocidos colectivamente como cromodepsinas, son herramientas farmacológicas importantes para su uso como terapias y herramientas para estudiar la función de GPCR45. Curiosamente, las cromodespinas se aislaron inicialmente de una planta (Ardisia crenata) utilizada en la medicina tradicional46. Posteriormente se descubrió que el compuesto en realidad era producido por una bacteria endosimbiótica perteneciente al género Burkholderia47. El papel ecológico de este compuesto no se comprende bien. Las cromodespinas demuestran una falta de inhibición hacia los GPCR de las plantas43. Se ha sugerido que pueden proporcionar un beneficio a su planta huésped al actuar como un elemento disuasorio para los herbívoros47. Curiosamente, se ha demostrado que las cromodespinas tienen actividad insecticida contra la chinche del frijol (Riptortus pedestris), además de inhibir los GPCR de los insectos plaga, la mosca blanca (Bemisia tabaci) y la polilla de la seda (Bombyx mori)45. Esto sugiere que las cepas de C. vacinnii también pueden ser útiles en el control de plagas de insectos.

Todos los genomas de Chromobacterium, excepto los dos genomas de C. phragmitis, contenían el compuesto pigmentado de color púrpura violaceína. Se ha informado que la violaceína tiene una variedad de propiedades bioactivas. Se ha demostrado que tiene propiedades antifúngicas contra una gran variedad de patógenos fúngicos fitopatógenos y humanos48. Se ha informado que tiene actividades antibacterianas49 y actividades antinematicidas50. El compuesto mostró actividades antialimentarias, larvicidas y pupicidas contra el gusano cogollero asiático (Spodoptera litura Fab.)51. Estas bioactividades de amplia base sugieren que la violaceína también puede contribuir al potencial de biocontrol de estas cepas de Chromobacterium.

La filogenia de la proteína PhlD (Fig. 2) sugiere que todos los grupos DAPG en Chromobacterium comparten un ancestro común y el ancestro más cercano que no es Chromobacterium probablemente se originó en el grupo Pseudomonas fluorescens. A partir del árbol filogenético es difícil inferir definitivamente si el grupo tuvo un evento de transferencia a Chromobacterium y algunos linajes descendientes perdieron el grupo biosintético o si ocurrieron otros eventos de transferencia horizontal de genes (THG) dentro del género Chromobacterium (por ejemplo, un HGT de C. vaccinii). a C. sinusclpearum).

En aislados de C. vaccinii de tipo salvaje, la producción de DAPG sólo pudo detectarse en cantidades mínimas. Los esfuerzos para aumentar la producción de DAPG mediante la detección de una variedad de condiciones de medios y fuentes de carbono no tuvieron éxito. Es posible que las moléculas en ambientes acuáticos induzcan la biosíntesis de DAPG en Chromobacterium. Sin embargo, confirmamos que los genes biosintéticos en Chromobacterium para la producción de DAPG estaban intactos y funcionales. Nuestros resultados también sugieren que el mecanismo regulador de las cepas de Chromobacterium es significativamente diferente al de las cepas de Pseudomonas, ya que carecen de los genes reguladores conocidos phlG y phlH12. Además, carecen de los genes reguladores postraduccionales de Pseudomonas rsmA y rsmE (datos no mostrados)12. Será necesario realizar más experimentos en el futuro para descubrir el mecanismo regulador de la producción de DAPG en Chromobacterium. Supusimos que la falta de actividad se debía a la falta de expresión de estos genes. Transferimos el grupo phlACB a E. coli para tener control directo sobre la expresión de estos genes. Las pruebas iniciales del transformante no lograron producir DAPG a partir de floroglucinol. Esto es consistente con observaciones previas de que la expresión del grupo phlACB en E. coli no produjo cantidades mínimas de DAPG2,52. Sin embargo, en estudios anteriores la reacción inversa, la conversión de DAPG en MAPG y floroglucinol, fue activa2,52. El seguimiento de la reacción inversa mostró una disminución dependiente del tiempo en la cantidad de DAPG presente en el medio cuando se expresó phlACB. Hubo un aumento en la UV270 nm en los tiempos de retención correspondientes a la masa exacta de MAPG y floroglucinol (Fig. 4E), lo que demuestra que el grupo podía convertir DAPG en MAPG y floroglucinol. Cabe señalar que en experimentos en los que se incubaron transformantes de phlACB que expresaban E. coli con floroglucinol en un intento de producir DAPG, el floroglucinol utilizado contenía una pequeña impureza de DAPG (<1%). Cuando se incubó con transformantes phlACB que expresaban E. coli, esta impureza de DAPG se convirtió en floroglucinol y no se observó reacción en la dirección de la formación de DAPG. Se desconoce por qué los transformantes phlACB favorecieron la producción de floroglucinol y no se produjo la biotransformación a DAPG. Sin embargo, Liu et al.52 demostraron recientemente una producción mejorada de DAPG en E. coli que expresa transformantes phlACB mediante la coexpresión de los genes acc, marA y phlE.

Un estudio de la literatura identificó algunos ejemplos de cepas de Chromobacterium que se están evaluando como posibles agentes de biocontrol para controlar patógenos de plantas22,23,24,25. Dos de los estudios utilizan Chromobacterium haemolyticum C-61, que mostró fuertes actividades antifúngicas contra varios patógenos de plantas23,24. Estos estudios identificaron otro nuevo lipopéptido cíclico al que denominaron cromobactomicina, que era responsable de la actividad observada24. El genoma está disponible para esta cepa y no contiene el grupo DAPG. Han et al. Se identificó Chromobacterium sp. JH7 durante un ensayo de detección para identificar antagonistas de Cylindrocarpon destructans, un patógeno de la pudrición de la raíz del ginseng22,23,24,25. Los autores no pudieron identificar la cepa a nivel de especie. Es posible que DAPG o el depsipéptido FR900359 puedan estar asociados con esta actividad, pero actualmente no hay datos que respalden esta especulación. En un estudio reciente, se demostró que C. vaccinii inhibe varios patógenos fúngicos de las plantas mediante la emisión de volátiles bioactivos22,23,24,25. No pudimos encontrar ninguna actividad DAPG informada en Chromobacterium sp. en la literatura.

Nuestros resultados confirman la presencia y actividad del grupo biosintético DAPG en el género Chromobacterium. Estos hallazgos y las investigaciones limitadas sobre la actividad de biocontrol contra patógenos vegetales por parte del género Chromobacterium sugieren que se justifican investigaciones adicionales en esta área.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado. Todos los datos de secuencia generados por nuestro laboratorio están disponibles en https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA782632.

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Los autores desean agradecer a Madeleine Adolf, Mark Doering y Heather Walker por su experta asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado en parte por el Servicio de Investigación Agrícola del Departamento de Agricultura de EE. UU. (Número de proyecto: 5010-22410-024-00-D). Cualquier opinión, hallazgo, conclusión o recomendación expresada en esta publicación pertenece a los autores y no refleja necesariamente la opinión del Departamento de Agricultura de EE. UU. La mención de nombres de empresas o productos comerciales no implica que el USDA los respalde o recomiende sobre otras empresas o productos similares no mencionados. El USDA es un proveedor y empleador que ofrece igualdad de oportunidades.

Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, Servicio de Investigación Agrícola, Centro Nacional de Investigación sobre la Utilización Agrícola, Unidad de Investigación sobre Bioprotección de Cultivos, 1815 North University St, Peoria, IL, 61604, EE. UU.

Eric T. Johnson y Christopher A. Dunlap

Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, Servicio de Investigación Agrícola, Centro Nacional de Investigación sobre la Utilización Agrícola, Unidad de Investigación de Bioenergía, 1815 North University St, Peoria, IL, 61604, EE. UU.

Michael J. Bowman

Instituto de Patología Tropical y Salud Pública, Universidad Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil

Raylane Pereira Gomes & Lilian Carla Carneiro

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Todos los autores enumerados han hecho contribuciones sustanciales o indirectas al trabajo y al diseño de experimentos. RPG recopiló las muestras y los datos. MB, CD realizó la metabolómica y analizó los datos y EJ realizó los experimentos de biología molecular, CD realizó la genómica comparativa, la filogenia y escribió el manuscrito. CD, MB, EJ, RPG y LCC leyeron el artículo y revisaron el manuscrito. Todos los autores aprovaron el manuscrito final.

Correspondencia a Christopher A. Dunlap.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Johnson, ET, Bowman, MJ, Gomes, RP et al. Identificación de la producción de 2,4-diacetilfloroglucinol en el género Chromobacterium. Informe científico 13, 14292 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41277-0

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Recibido: 01 de marzo de 2023

Aceptado: 24 de agosto de 2023

Publicado: 31 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41277-0

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