Identificación, clasificación y perfilado de células asesinas funcionales mediante la captura de un objetivo fluorescente.

Ingeniería Biomédica de la Naturaleza (2023)Citar este artículo

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Los ensayos para evaluar la citotoxicidad mediada por células se centran en gran medida en las células diana y no pueden identificar ni aislar subpoblaciones de células efectoras citotóxicas. Aquí describimos un ensayo compatible con la citometría de flujo para la identificación y clasificación precisas de subpoblaciones de células asesinas funcionales en cocultivos. El ensayo, que denominamos PAINTKiller (por 'identificación por transferencia intracelular de proximidad y afinidad de células asesinas'), se basa en la detección de una proteína fluorescente intracelular 'pintada' por una célula lisada en la superficie de la célula citotóxica lisante (específicamente, en la superficie celular). lisis, el éster succinimidílico de carboxifluoresceína derivado de fluoresceína intracelular es capturado en la superficie de la célula asesina natural por un anticuerpo para el isotiocianato anti-fluoresceína unido a un anticuerpo para el receptor de superficie panleucocitario CD45). El ensayo puede integrarse con la secuenciación de ARN unicelular para el análisis de vías moleculares asociadas con la citotoxicidad celular y puede usarse para descubrir correlatos de respuestas inmunes funcionales.

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Los conjuntos de genes distintivos seleccionados están disponibles públicamente en Molecular Signatures Database (MSigDB, v.7.4). Los datos de secuenciación de PAINTKiller-seq están disponibles en la base de datos GEO, con número de acceso GSE207508. Todos los datos necesarios para evaluar las conclusiones descritas en este artículo se incluyen en el documento y su información complementaria. Los conjuntos de datos sin procesar y analizados generados durante el estudio están disponibles para fines de investigación a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable. Los datos originales se proporcionan con este documento.

El código R para reproducir los análisis mostrados en las figuras está disponible en Zenodo en https://doi.org/10.5281/zenodo.8004120.

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Agradecemos el apoyo técnico del Laboratorio de Citometría de Flujo (Clúster de Ciencias Médicas de NUS) para la clasificación de células. LFC recibió el apoyo para la investigación descrita en este estudio del Consejo Nacional de Investigación Médica (MOH-OFIRG18nov-003), el Ministerio de Educación de Singapur (MOE-T2EP30120-0008) y la Alianza Singapur-MIT para la Investigación y la Tecnología de Análisis Crítico para la Fabricación. Grupo de Investigación Interdisciplinar de Medicina Personalizada (SMART CAMP).

Estos autores contribuyeron igualmente: Yen Hoon Luah, Tongjin Wu.

Instituto de Innovación y Tecnología en Salud, Universidad Nacional de Singapur, Singapur, Singapur

Yen Hoon Luah, Tongjin Wu y Lih Feng Cheow

Grupo de Investigación Interdisciplinaria de Análisis Crítico para la Fabricación de Medicina Personalizada, Alianza Singapur-MIT en Investigación y Tecnología, Singapur, Singapur

Yen Hoon Luah y Lih Feng Cheow

Departamento de Ingeniería Biomédica, Facultad de Diseño e Ingeniería, Universidad Nacional de Singapur, Singapur, Singapur

Tongjin Wu y Lih Feng Cheow

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LFC, YHL y TW concibieron y diseñaron el estudio. TW realizó los experimentos correspondientes a las Figs. 2, 4 y 7. YHL realizó los experimentos correspondientes a la Fig. 3. TW y LFC realizaron el análisis de datos PAINTKiller-seq. LFC, TW y YHL escribieron el manuscrito. Todos los autores comentaron el manuscrito y aprobaron el envío.

Correspondencia a Lih Feng Cheow.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Biomedical Engineering agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Datos de expresión genética sin filtrar de dos carriles de secuenciación ('Exp. 1' y 'Exp. 2'). Las células con los siguientes criterios se filtraron para el análisis posterior: números de genes> 1200 y <8000, recuentos de expresión genética> 1000 y <40 000, genes mitocondriales <10% del total de genes detectados. b, Las muestras de células, incluido el grupo de cocultivo NK-K562 ('NK + K562'), el grupo solo NK ('solo NK') y el control de tinción de isotipo ('Isotipo ctrl'), se demultiplexaron según su intensidad de tinción de anti -β2M hashtags. Los números de celda de cada grupo se muestran entre paréntesis.

a, b, Las células se agruparon según sus perfiles transcripcionales (a) y las células no NK se excluyeron según la expresión de genes asociados al linaje, como CD3E para células T y HBA1/HBA2 para células K562 (b). c, las células NK se reagruparon según sus perfiles transcripcionales. Se identificaron un total de 13 conglomerados. Los grupos 6 y 7 se encontraron principalmente en muestras NK que se cultivaron conjuntamente con células K562.

Figuras y tablas complementarias.

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Reimpresiones y permisos

Luah, YH, Wu, T. & Cheow, LF Identificación, clasificación y perfilado de células asesinas funcionales mediante la captura de lisado fluorescente de células diana. Nat. Biomédica. Ing (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01089-z

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Recibido: 15 de julio de 2022

Aceptado: 04 de agosto de 2023

Publicado: 31 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01089-z

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